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PCR擴增試劑盒使用后可擴增出多條DNA片段

瀏覽次數(shù):1105發(fā)布日期:2021-08-19
  PCR擴增試劑盒是從克隆有ThermuaquaticusDNAPolymerase基因的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達后,再經(jīng)三次過柱純化分離出來的一個約94KD的重組蛋白。無外源核酸酶和細菌DNA污染,穩(wěn)定性好,特異性強,適用于各種PCR擴增。本試劑盒已經(jīng)包括了PCR擴增使用的各種試劑,便于客戶配套使用。使用本制品擴增得到的PCR產(chǎn)物的3'端附有一個A堿基,因此可直接克隆于T-Vector中。
  所謂多重PCR(MultiplexPolymeraseChainReaction,mPCR),也稱復(fù)合PCR,由Chambehian'在1988年提出(Chambehian'et.al.NucleicAcidsRes.1988Dec9;16(23):11141–11156.),基本原理與常規(guī)PCR相同,區(qū)別在于多重PCR的反應(yīng)體系是加入多對引物,各對引物分別結(jié)合在模板的相應(yīng)位置,擴增出多條DNA片段。
  PCR擴增試劑盒實驗注意事項:
  1.進行PCR反應(yīng)前,可以將所有g(shù)DNA的濃度稀釋到同一濃度,并轉(zhuǎn)移到PCR8聯(lián)管中,一方面是便于排槍操作,另一方面是加入相同起始量的gDNA,這樣可以降低文庫的濃度差異,便于混合文庫。
  2.大多數(shù)情況下引物是1管,操作相當方便;當目標區(qū)域是外顯子或者是其他連續(xù)區(qū)域時,我們會把引物分裝為2管,分別命名PrimerpoolT1與PrimerpoolT2,這時需要第二輪PCR前把產(chǎn)物合并,再進行下一步反應(yīng)。
  3.執(zhí)行多重PCR反應(yīng)時,特別是樣本量多的情況下,可以將T1設(shè)為一組,T2設(shè)為一組,便于制備反應(yīng)試劑混合液和排槍操作;并把解凍好的試劑放置在冰盒上,在冰盒上進行加樣操作。
  4.在實驗中,可以在PCR管壁上和管蓋上同時進行反應(yīng)編號標記,防止高溫或其他原因?qū)е掠浱栂В苊夂罄m(xù)產(chǎn)物混合操作失誤,造成樣本交叉污染。
  5.第二輪PCR后,因為YFBufferB試劑比較粘稠,在清洗純化的時候不能吸走所有試劑,可以剩余5-10μl,否則會把磁珠一起吸走,造成樣品的損失,導(dǎo)致產(chǎn)物回收率下降。
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